脱细胞软骨细胞外基质对小鼠巨噬细胞系表型的(3)
2.6 诱导后巨噬细胞表型鉴定 将M0型巨噬细胞接种在ACECM 支架上体外极化诱导4 d 后,冰冻切片以M1型巨噬细胞特征性表面标志物CD86(绿色)和M2型巨噬细胞特征性表面标志物CD206(红色)进行免疫荧光双重染色鉴定,结果显示M2型巨噬细胞特征性表面标志物CD206 呈80%的高阳性表达,提示细胞-支架复合物中有大量的M2型巨噬细胞存在;而M1型巨噬细胞特征性表面标志物CD86 的阳性表达甚少(图6)。
图 1 |脱细胞软骨细胞外基质支架大体及组织学染色观察Figure 1 |General observation and observation of histological staining of acellular cartilage extracellular matrix scaffold图注:A 为支架大体观,为规则圆形,表面光滑;B 为支架扫描电镜图,呈规则管状排列,疏松,有明显的三维立体结构;C 为支架天狼星红染色,胶原成分得到很好的保留;D 为支架番红O 染色,保留了原有的特异性的糖胺多糖成分;E 为支架甲苯胺蓝染色,保留了原有的特异性的糖胺多糖成分;F 为支架苏木精-伊红染色,无细胞核结构
图 2 |M0型巨噬细胞形态观察Figure 2 |Morphological observation of M0macrophages图注:A 为复苏1 d的M0型巨噬细胞;B 为 复 苏4 d 的M0型巨噬细胞
图 3 |脱细胞软骨细胞外基质支架上巨噬细胞特征性表面标志物CD68免疫荧光染色观察Figure 3 |Immunofluorescence staining of macrophage specific marker CD68 on acellular cartilage extracellular matrix scaffold图注:A 为DAPI 染色,B 为CD68 特异染色,C 为A 和B 叠加图。细胞-支架复合物中有M0型巨噬细胞特征性表面标志物CD68 阳性表达
图 4 |巨噬细胞-脱细胞软骨细胞外基质支架复合物扫描电镜图Figure 4 |Scanning electron microscopy of macrophage-acellular cartilage extracellular matrix scaffold complex图注:复合物中的巨噬细胞为原来的圆形或类圆形,沿着支架的管状排列,广泛分布在支架的表面及内部结构中
图 5 |巨噬细胞-脱细胞软骨细胞外基质支架复合物死/活细胞染色观察Figure 5 |Observation of dead/living cell staining of macrophage-acellular cartilage extracellular matrix scaffold complex图注:图A 显示大多数为活细胞,呈绿色荧光染色;B 显示极少数死细胞,呈红色荧光染色;C 为 A 和B 叠加图
图 6 |脱细胞软骨细胞外基质支架上巨噬细胞特征性表面标志物CD206与CD86 免疫荧光染色观察Figure 6 |Immunofluorescence staining of macrophage specific markers CD206 and CD86 on acellular cartilage extracellular matrix scaffold图注:A 为DAPI 染色;B 为CD86 特异染色;C 为CD206 特异染色;D 为A、B 和C 叠加图;E 为巨噬细胞特征性表面标志物CD206 与CD86 阳性百分比(n=5)
3 讨论 Discussion
巨噬细胞是免疫系统的多功能和可塑性效应细胞,参与多种免疫功能,包括清除病原体或凋亡细胞、激活和化解炎症及组织愈合,巨噬细胞一直被认为是重要的免疫效应细胞。越来越多的证据表明,从炎症性M1表型到抗炎M2表型的适当转变有利于软骨内骨化的骨再生[19-20]。巨噬细胞所处的微环境不同会出现不同的极化状态。一般情况下,巨噬细胞在脂多糖、γ 干扰素、肿瘤坏死因子α 和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等炎性因子刺激时极化为M1型巨噬细胞,能被 Toll 样受体4、胶原结构巨噬细胞受体、CD86 等识别,分泌促炎因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素12、白细胞介素6、诱导性一氧化氮合酶等发挥杀菌、杀死肿瘤细胞的功能[21]。巨噬细胞在白细胞介素10、白细胞介素13、转化生长因子β等抗炎性因子或细胞因子的刺激下可极化为M2型巨噬细胞,能被CD163、CD206 和FIZZ1、精氨酸酶1 等识别,分泌白细胞介素10、转化生长因子β 等,发挥抗感染、促进组织再生和修复等功能[22]。
ACECM 支架取自天然软骨组织,所以可以更好地为种子细胞提供生长、繁殖、分化的微环境,又经过脱细胞的处理,可以在最大限度上去除其原有的免疫原性,保留细胞外基质中的胶原及蛋白聚糖等有利于细胞增殖分化的成分[23]。在前期研究的基础上,此次实验旨在探究猪来源ACECM 支架对小鼠巨噬细胞系表型极化的调控。为确保实验室前期所制备的ACECM 支架中无细胞残留,且其结构和成分均适合细胞生长,将ACECM 支架进行了扫描电镜和组织化学染色(苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、番红O 染色、天狼星红染色)处理,结果证明了该支架中无细胞残留,其成分均得到很好的保留。接下来,将M0型巨噬细胞接种至ACECM 支架中构建细胞-支架复合物,为观察M0型巨噬细胞在ACECM 支架上的生长情况,取在体外极化诱导4 d 的细胞-支架复合物,扫描电镜观察显示细胞-支架复合物中的巨噬细胞仍为原来的圆形或类圆形,沿着支架的管状排列,广泛分布在支架的表面及内部结构中,巨噬细胞在ACECM 支架上黏附良好;死/活细胞染色共聚焦观察显示,ACECM 支架上附着的大部分细胞为绿色荧光的活细胞,仅有少数细胞为红色荧光的死细胞,巨噬细胞在ACECM 支架上生长良好,且具有很高的存活性。为进一步探究ACECM 支架对巨噬细胞的极化诱导能力,取体外极化诱导4 d 的细胞-支架复合物进行免疫荧光染色观察,M1型巨噬细胞用其特征性表面标志物CD86 标记(绿色),M2型巨噬细胞用其特征性表面标志物CD206标记(红色),荧光显微镜观察可见细胞-支架复合物中有M2型巨噬细胞特征性表面标志物CD206(红色)的高阳性表达,而M1型巨噬细胞特征性表面标志物CD86(绿色)呈弱阳性甚至没有表达,即M0型巨噬细胞可被诱导极化成修复性M2型巨噬细胞,这为软骨组织的再生提供了良好的免疫微环境,对软骨再生具有重要意义。
文章来源:《细胞与分子免疫学杂志》 网址: http://www.xbyfzmyxzz.cn/qikandaodu/2021/0215/449.html
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