脱细胞软骨细胞外基质对小鼠巨噬细胞系表型的(2)
1.4.3 巨噬细胞的培养和传代 复苏RAW264.7 巨噬细胞,添加到含有体积分数10%胎牛血清、高糖型DMEM(HDMEM)培养基的75 cm2培养瓶中,置于37 ℃、含体积分数5%CO2的细胞培养箱中培养,每2 d 更换一次培养液,相差显微镜下观察巨噬细胞生长情况,待细胞生长至80%-90%融合时进行传代备用。
1.4.4 巨噬细胞M0型免疫鉴定 将培养后的巨噬细胞制成细胞悬液,计数,1 500 r/min 离心5 min,弃上清,滴加巨噬细胞培养液重悬制成1×1010L-1的细胞悬液。用20 μL 移液枪吸取10 μL 细胞悬液(1×105细胞)接种在ACECM 支架上,构成细胞-支架复合物,置于37 ℃、含体积分数5%CO2细胞培养箱中培养4 d后,在OCT中包埋,进行冰冻切片(约7 μm厚),室温下丙酮固定30 min,PBS 浸洗切片,室温通透30 min,PBS 浸洗切片,在切片上滴加1%BSA,室温封闭30 min,每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗CD68(1 ∶500)并放入湿盒,4 ℃孵育过夜;PBS 浸洗后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中孵育,PBS 浸洗切片,最后滴加DAPI 避光进行染核,PBS 洗去多余的DAPI,用含抗荧光淬灭剂的封固液封固,荧光显微镜下观察。
1.4.5 巨噬细胞的极化诱导 将3 个直径3.5 mm、厚1 mm 的ACECM 支架分别置于无菌的48 孔板中,取培养后的巨噬细胞,制成细胞悬液,计数,1 500 r/min 离心5 min,弃上清,滴加巨噬细胞培养液重悬制成1×1010L-1的细胞悬液。用20 μL 移液枪吸取10 μL 细胞悬液(含细胞1×105)滴加到支架上,然后将48 孔板移至37 ℃、含体积分数5%CO2的细胞培养箱中孵育。每隔30 min 用20 μL 移液枪吸取适当的巨噬细胞培养液滴加至细胞-支架复合物上,保证细胞-支架复合物处于湿润状态。4 h 后每孔加入1 mL 巨噬细胞培养液,隔天换液。
1.4.6 扫描电镜观察 对构建的细胞-支架复合物体外极化诱导4 d 后取出,PBS 冲洗,在2.5%戊二醛及1%锇酸中进行固定,PBS 冲洗干净,梯度乙醇进行脱水,醋酸异戊酯中浸泡40 min,六甲基二硅胺烷干燥,粘托,样品表面电镀喷金后扫描电镜下观察。
1.4.7 死/活细胞染色共聚焦观察 对构建的细胞-支架复合物体外极化诱导4 d 后取出,PBS 冲洗2 次,按照死/活细胞染色试剂盒说明书操作,将A、B 混合进行染色,在共聚焦激光显微镜下观察细胞-支架复合物上巨噬细胞的生长情况。
1.4.8 诱导后巨噬细胞表型鉴定 对体外极化诱导4 d 的细胞-支架复合物在OCT 中包埋,进行冰冻切片(约7 μm 厚),室温下丙酮固定30 min,PBS 浸洗切片,室温通透30 min,PBS 浸洗切片,在切片上滴加1%BSA,室温封闭30 min,每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗(CD86+CD206)并放入湿盒,4 ℃孵育过夜;PBS 浸洗后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中孵育,PBS 浸洗切片,最后滴加DAPI 进行染核,PBS 洗去多余的DAPI,用含抗荧光淬灭剂的封固液封固后,200 倍荧光显微镜观察拍摄,每个支架拍摄3 个不同视野,采用Image J 进行荧光定量分析,采用GraphPad prism 7 进行绘图处理。
1.5 主要观察指标 巨噬细胞在ACECM 支架的黏附情况和生长情况,M2型巨噬细胞特征性表面标志物CD206 在细胞-支架复合物中的表达情况。
2 结果 Results
2.1 ACECM 支架大体观 制备成的ACECM 支架大体观为规则圆形,表面光滑(图1A)。扫描电镜显示ACECM 支架呈规则管状排列,疏松,有明显的三维立体结构(图1B)。
2.2 ACECM 支架组织学染色 天狼猩红染色显示ACECM 支架胶原成分得到很好的保留(图1C),番红O 染色和甲苯胺蓝染色均呈阳性(图1D,E),表明该ACECM 支架保留了原有的特异性的糖胺多糖成分;苏木精-伊红染色后未见蓝染的情况,显示无细胞核结构(图1F)。
2.3 M0型巨噬细胞观察 倒置显微镜下观察显示,M0型巨噬细胞大多呈接触式生长,为圆形或类圆形,无伪足,贴壁牢固(图2)。
2.4 M0型巨噬细胞免疫荧光染色鉴定 用M0型巨噬细胞特征性表面标志物CD68(红色)标记细胞,荧光显微镜观察可见细胞-支架复合物中有M0型巨噬细胞特征性标志物CD68阳性表达(图3),提示接种的细胞为M0型巨噬细胞。
2.5 巨噬细胞的极化诱导
2.5.1 大体观察 体外极化诱导4 d 后,细胞-支架复合物仍然呈规则的完整圆形结构,疏松具有弹性,镊子挤压后仍可恢复原来的形状。
2.5.2 扫描电镜观察 体外极化诱导4 d 后,细胞-支架复合物中巨噬细胞为原来的圆形或类圆形,沿着支架的管状排列,广泛分布在支架的表面及内部结构中(图4),表明巨噬细胞在ACECM 支架上黏附良好。
2.5.3 死/活细胞染色共聚焦观察 支架上附着的大部分细胞为活细胞的绿色荧光,仅有极少数细胞为死细胞的红色荧光(图5),表明支架上巨噬细胞生长良好且具有很高的存活性。
文章来源:《细胞与分子免疫学杂志》 网址: http://www.xbyfzmyxzz.cn/qikandaodu/2021/0215/449.html
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